1884年5月1日，本於西螺教會聚會之斗六地區信徒，移會回斗六於信徒之住宅聚會，此乃本教會設教之日，自1886年至1893年，由台南教會遴派七位傳道師輪流前來斗六協助牧師之工作，此期間，信徒數遽增，遂思購地建堂，得梅監霧牧師、劉萬劍長它及吳祿長老娘之奉獻，而購地欲建禮拜堂，但該地段被政府徵用而換取現今教會之用地。1918年由林學恭牧師於本教會組織長老督會(今之小會)，而使教會步上正軌，林牧師在斗六教會牧會凡十三年，頗具建樹。1932年教會正式登記為長老教會南部大會財團法人名下。至１９５１年教會開辦信愛幼稚園，此乃斗六幼兒教育之先鋒。1955年新建禮拜堂落成，即現今之禮拜堂。
1984年設教百週年，適逢李聰顯牧師在任，舉辦了一系列之慶典活動，誠屬盛況空前。綜觀斗六教會創設至今116年，上帝的引領一直與斗六教會同在，唯願教會更能以好見證來回應上帝的愛。
