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民族路教會的前身是一間日本基督教會。從1897年起，日本基督教團由台北開始，後延伸至各地創立日本教會。細川瀏牧師是日本接管台澎時，由南路枋寮上陸的乃木軍之隨軍慰問使，他曾協助巴克禮牧師及宋忠堅牧師二位宣教師帶日本軍無流血進入台南府城。嗣後更幫助巴牧師照顧台灣南部各教會，使得當時教會人數加添、教勢進步。
隨後他於1898年6月中旬正式被日本基督教會傳道局派遣到台南。從7月1日起借用亭仔腳（太平境）禮拜堂為「日本基督教會台南講義所」，牧養日本信徒並兼任台南神學院日語講師。
有一位熱心愛主經營餅舖的信徒，名叫鳥居萬之助先生，他提供紅葉軒餅舖的二樓給細川瀏牧師當作查經聚會之所。經過一段時日之後，聚會人數日增，遂於1902年3月15日正式成立教會，購得竹屋町（即現在民族路教會會址），將一民房改為禮拜堂，定名為「台南日本基督教會」細川瀏牧師為首任牧師。
1945年8月15日第二次大戰結束，日本人受遣送回國，自然所有日本信徒在依依不捨中全部離開，教會一切會務由本地信徒接任，於是成立了「民族路教會」。
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